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行業動態 Industry News

達立通顆粒整體質量研究進展(十四)

發布時間:2024-02-23 11:09:17 | 來源:【藥物研發團隊 2024-2-23】
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依據《中藥復方制劑整體質量評價體系的構建及應用》中關于構建中藥復方制劑整體質量評價體系的技術路線,按照《達立通顆粒整體質量研究方案》,開展達立通顆粒整體質量評價研究,包括研發立項研究、組方和方解研究、中藥材/飲片質量研究、生產過程控制技術研究、作用機制研究、質量標志物和生物標志物研究、循證醫學研究、藥物經濟學研究。根據項目進展情況,我們將陸續報道相關研究成果。

本期介紹達立通顆粒治療功能性消化不良的作用靶點和藥效化學標志物確證研究成果。

1.概述

功能性消化不良(FD)是一種常見的腸-腦相互作用障礙性疾病,臨床上以餐后飽脹、早飽或上腹痛/上腹燒灼感等無器質性病變,與明確的結構病理無關的典型癥狀為診斷依據(Black et al.,2022;Sahan et al.,2018)。目前,各種已被證明有效的治療方法包括幽門螺桿菌根除療法、質子泵抑制劑、組胺-2受體拮抗劑、促動力藥、中樞神經調節劑和心理輔助技術等。然而,長期使用質子泵抑制劑與肝腎毒性和癌癥風險增加有關(Ford et al.,2020)。FD患病率高,缺乏明確的診斷試驗和有效的治療策略,是一種具有挑戰性的疾?。⊿ayuk and Gyawali,2020)。因此,發現新的治療方法是當務之急。

長期以來,傳統中醫藥(TCM)理論和天然中草藥被廣泛應用于功能性胃腸病的初始治療(Chang et al.,2016)。TCM在治療FD方面具有明顯的優勢。雖然不像化學藥物那么快,但療效穩定,不良反應少,復發率低(Hao et al.,2017)。而且中藥復方制劑可以達到減毒增效的效果(Gao et al.,2023;Song et al.,2022b)。達立通顆粒(DLT)是由柴胡、枳實、木香、陳皮、清半夏、蒲公英、焦山楂、焦檳榔、雞矢藤、黨參、延胡索和六神曲(炒)組成的傳統中藥復方,是我國應用最多的促進胃腸動力的中成藥之一。此外,也有研究證實了DLT的有效性、安全性和經濟性(Zhang and Guo,2015),在治療FD患者的胃腸運動性障礙方面具有顯著的作用?;谥暗难芯浚⊿u et al.,2023),研究者對DLT的化學組成和體內代謝有了一定的了解。然而,DLT治療功能性消化不良的藥理作用機制、作用靶點、藥效物質基礎尚未完全闡明。

譜效關系分析是一種基于多種化學計量學方法的相關性分析方法,如線性回歸分析、灰色關聯分析(GRA)和主成分分析(PCA),以建立化學成分與藥效學指標之間的聯系(Lv et al.,2023;Xu et al.,2022)。它克服了色譜圖的缺點,在確定TCM所用制劑的活性成分方面起著至關重要的作用(Du et al.,2021)。隨著生物信息學的發展,網絡藥理學作為一種在系統水平上分析TCM與疾病之間分子關聯的綜合方法,已被廣泛應用于藥物和中藥活性成分的發現、中藥治療機制的解釋和藥物組合的分析等方面(Li et al.,2022)。此外,代謝組學也已在中藥藥理、毒理等研究中廣泛應用,藥效學研究模型因其敏感性、方便性、可靠性和高效性而備受關注。斑馬魚與人類具有87%的遺傳相似性,且具有發育快、易繁殖、行為解剖觀察方便、成本低、實驗周期短等優點(Lachowicz et al.,2023),目前已廣泛應用于藥品、食品和保健品的有效性和安全性評價(Tonon and Grassi,2023)。之前的研究人員已經構建了斑馬魚腸蠕動模型和篩選促胃腸動力藥物的方法(Zhou et al.,2014)。在本研究中,研究人員參考此方法,用鹽酸洛哌丁胺對斑馬魚進行建模。

為了確證DLT中的抗FD成分,采用“譜效關系-網絡藥理學”整合策略。隨后,建立斑馬魚腸蠕動模型進行藥效學驗證。因此,采用譜-效關系策略,探究不同溶劑提取的DLT中化學成分信號強度與藥效學指標的相關性。同樣,通過構建"藥物-疾病"網絡藥理學分析方法,確定了DLT中抗FD的關鍵成分和靶點。最后,建立斑馬魚模型驗證其療效。

值得注意的是,本研究篩選并驗證了DLT抗FD的關鍵靶點和關鍵成分,為探索DLT治療FD作用機制、藥效化學標志物和生物標志物以及臨床用藥提供了理論依據。

2.材料和方法

2.1材料和試劑

達立通顆粒(批號:J210522)由南昌弘益藥業有限公司生產。甲醇和乙腈(HPLC級)購自默克公司,甲酸LC-MS級)由阿拉?。ㄖ袊虾#┨峁?。超純水采用Milli Q系統(密理博,貝德福德,MA,USA)制備。

桔皮素、延胡索乙素、5-O-去甲基川陳皮素、川陳皮素、紫堇堿、金絲桃苷、檸檬苦素和四氫小檗堿均購自瑞芬思公司(中國成都)。橙皮苷購自上海源益生物科技有限公司(中國上海)。本研究采用的其他純度大于98.0%(HPLC)的化學參比物質的詳細信息在我們之前的研究中都有展示。多潘立酮和鹽酸洛哌丁胺由阿拉?。ㄖ袊虾#┨峁?。尼羅紅購自MedChemExpress(中國北京)。二甲基亞砜購自上海泰坦化學有限公司(中國上海)。

2.2動物

134只體重為18g~22g的雄性ICR(中國醫學科學院腫瘤研究所)小鼠由上海市計劃生育科學研究院實驗動物室提供(中國上海),實驗動物許可證號為SYXK(Hu)-2018-0002和SYXK(Hu)-2018-0006。所有動物處理均按照美國國立衛生研究院的《實驗動物護理和使用指南》進行。動物實驗方案經南京中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準。

2.3儀器和UPLC條件

UPLC-Q-TOF/MS/MS(AB Sciex)分析系統由UPLC系統(LC-20A、島津)和配備電子噴霧電離(ESI)的四極桿飛行時間質譜儀(AB Sciex)組成。色譜分離采用Hypersil GOLDTM柱(3μm,2.1mm×100mm),柱溫40℃,流速0.4mL/min。流動相A為水和甲酸(0.1%,v/v),流動相B為乙腈。

洗脫程序按以下梯度進行:0~5min,10% B;5~44min,90% B;44~46min,90% B;46~47min,10% B;47~50.10min、0;進樣量為3μL。

質譜參數設定為:掃描范圍m/z 50~1500,正/負離子模式;氣簾氣(GUR),40 psi;霧化氣(GS1)和輔助氣(GS2),55 psi;離子噴霧電壓,5500V/-5500V;碰撞能量,10V/-10V;去簇電壓為100V/-100V;ESI溫度為550℃。

2.4用不同溶劑提取達立通顆粒的化學成分

精確稱量DLT 15份,每份重量為57.5g,相當于生藥100g。DLT依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和75 %乙醇提取3次。合并相應組分,得到DLT提取物5個組分(n=3),濃縮至約100mL。使用真空離心濃縮儀(Thermo Scientific)在45?℃下干燥各提取物1mL,殘渣加入800μL甲醇后超聲復溶30min,確保最終濃度為1.25g生藥/mL,在12000r/min下離心10 min后,分別收集所有樣品的上清液。

2.5動物及給藥

小鼠于室溫22?±?2?℃、相對濕度55?±?5 %、晝夜分明(每天光照和黑暗各12h)的標準環境中飼養一周,自由攝食和飲水。

2.5.1實驗餐的制備

10g羧甲基纖維素鈉溶于250mL水中,分別加入16g奶粉、8g蔗糖、8g淀粉和2g活性炭,攪拌均勻,配制成300mL黑色半固體糊。

2.5.2 DLT對正常小鼠胃腸運動的促進作用

根據實驗需要,給藥前將24只雄性小鼠隨機分為4組(n?=?6只/組):對照組和DLT給藥組。在DLT給藥組中,根據人體臨床劑量(實驗劑量按原始劑量計算)選擇給藥劑量,分別相當于人體每日給藥劑量的1/2倍、1倍、2倍,作為低、中、高劑量組。小鼠每天灌胃1次(統一在上午8:30),連續7天,對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水。第7天給藥45min后,實驗餐(20mL/kg,末次給藥前禁食24h)灌胃給藥。20min后頸椎脫臼處死小鼠并解剖。記錄幽門至回盲部(小腸全長)的總長度(TL)和幽門至半固體糊前端的長度(L),根據以下公式計算腸道推進率。

腸道推進率=L/TL×100%

2.5.3 DLT不同組分對正常小鼠胃腸運動的促進作用

根據實驗需要,將110只雄性小鼠隨機分為11組(n=10只/組):對照組和DLT不同溶劑萃取處理組,每組重復2次,包括石油醚組分(PE)、乙醚組分(EE)、乙酸乙酯組分(EA)、正丁醇組分(NB)、水提醇沉組分(WEAP)5個組分。各組灌胃給予(對照組給予相同劑量的生理鹽水)10.5g/kg,每天1次,連續7d。實驗餐的給藥方法和腸道推進率的計算見2.5.2。

2.6多元統計分析

2.6.1主成分分析(PCA)

PCA基于數據降維的原理,在保持數據集最大方差貢獻率的同時,將指標簡化為具有代表性的綜合指標(Hong et al.,2021)。本研究采用MetaboAnalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml)分析5個不同組分中原型化合物的差異。

2.6.2灰色關聯分析(GRA)

灰色關聯分析是一種確定樣本與被測對象之間關系的評價方法(Shi et al.,2021)。本研究采用均值變化法對原始數據進行無量綱化處理,以腸道炭末推進率為小鼠藥效指標為母序列,以不同組分DLT的108個峰面積為子序列,計算關聯度(r)?;疑P聯度值越大,表明代表色譜峰的化學成分與腸推進率的關聯度越大。根據平均相關值大于1篩選出主要活性化合物。

2.6.3正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

OPLS-DA是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法。它是PLS的一種變體,使用正交信號校正來最大化第一個潛變量上X和Y之間的解釋協方差(Abdelhafez et al.,2019;Qiao,X. et al.,2021)。它可以簡化模型,使其易于解釋。本研究將5個組分的共有峰面積設為X變量,各藥效實驗結果設為Y變量。預測變量投影重要性(VIP)值反映了X變量對Y變量的貢獻程度。VIP值越大,貢獻越大。采用SIMCA-P14.1建立OPLS - DA模型,根據VIP值和系數篩選主要活性化合物。

2.7網絡藥理學分析

2.7.1發現DLT的活性成分和作用靶點

根據前期研究,從PubChem數據庫中獲取DLT給藥后吸收進入胃腸道的62個成分的SMILE編號(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。然后,通過輸入SMILE編號(http://www.swisstargetprediction.ch/?),在Swiss Target Prediction數據庫中預測各胃腸成分的靶點(所選物種為“人類”,“概率”>0.5)。

2.7.2活性化合物-靶點網絡的構建

DLT的潛在活性成分及匹配靶點導入Cytoscape3.8.2進行可視化,構建DLT成分-靶點網絡,并根據各成分的Degree值對DLT中的促胃腸動力成分進行排序。在化合物-靶點網絡中,每個成分或靶點用一個節點表示,成分與靶點之間的關系用一條連線表示。

2.7.3獲得與藥物和疾病匹配的交集靶點

通過在OMIM數據庫(https://www.omim.org/),Gene Cards數據庫(https://www.genecards.org/)(選擇相關性得分>10)以及DisGeNET(https://www.disgenet.org/)中分別輸入" Functional dyspepsia "檢索詞得到FD相關的活性靶點,整合3個數據庫的信息得到FD相關的靶點信息,并結合文獻形成FD相關作用的靶點庫。然后通過Excel對相應靶點與疾病對應靶點進行韋恩圖(Venny)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析,得出DLT作用于FD的靶點。

2.7.4蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

為進一步研究DLT與FD靶點的相互作用,采用String (https://string-db.org/)提供的蛋白標識符或蛋白序列進行分析。

研究蛋白質之間的相互作用網絡有助于確定核心調控基因。目前已經有很多蛋白質相互作用數據庫,其中String數據庫覆蓋的物種最多。該系統中具體設置如下:在有機體列中選擇“人類”,在網絡邊的含義列中選擇“證據”,置信度設置為>0.9,去除游離蛋白,獲取靶點之間的關聯數據,將獲取的數據導入Cytoscape 3.7.2中,構建PPI網絡。

DLT作用于功能性消化不良的靶點導入String數據庫(https://cn.string-db.org/)獲取蛋白相互作用信息,并保存為TSV文件格式,導入Cytoscape構建相互作用網絡圖,挖掘出與FD發生發展密切相關的前10個關鍵靶點。

2.8達立通顆粒對斑馬魚模型抗功能性消化不良效果評價

2.8.1斑馬魚的攝食和產卵

斑馬魚成魚的養殖條件為:水體電導率450~550mS/cm,pH7.0~7.3,溫度約26~28℃,硬度53.7~71.6mg/L CaCO3,每天光照14 h,黑暗10 h,每天定時投喂2次剛孵化的鹵蟲。每次設置4~5對斑馬魚進行自然交配。平均產生200~300枚胚胎。在受精后6h和24h對胚胎進行清洗和分期。受精后5天(5dpf)發育正常的幼魚可用于進一步實驗。

2.8.2最大耐受濃度的確定

360尾5dpf 斑馬魚幼魚隨機置于12孔微孔板中,每孔10尾。每孔加入不同濃度的藥物,包括桔皮素、延胡索乙素、5 - O -去甲基川陳皮素、川陳皮素、紫堇堿、橙皮苷、金絲桃苷、檸檬苦素、四氫小檗堿。未處理的對照斑馬魚進行平行檢測。處理24h后,觀察并記錄斑馬魚死亡情況,確定各藥物對斑馬魚的最大耐受濃度(MTC)。

2.8.3斑馬魚腸道蠕動模型的構建及藥物治療

225尾5dpf 斑馬魚幼魚隨機分為12組,置于12孔微孔板中,每組15尾。一組以多潘立酮(30μg/mL)為陽性對照,其余11組分為正常對照組、模型組、桔皮素組(20μg/mL)、延胡索乙素組(37.5μg/mL)、5 - O -去甲基川陳皮素組(10μg/mL)、川陳皮素組(12.5μg/mL)、紫堇堿組(37.5μg/mL)、橙皮苷組(200μg/mL)、金絲桃苷組(300μg/mL)、檸檬苦素組(200μg/mL)、四氫小檗堿組(75μg/mL)。每組加入1mL 10μg/mL的尼羅紅,孵育16h后,用新鮮的胚胎培養基清洗斑馬魚以去除染料。對照組用胚胎培養水正常培養,其余10組采用鹽酸洛哌丁胺法構建腸道蠕動斑馬魚模型。鹽酸洛哌丁胺濃度為10μg/mL,同時各組給予相應藥物1mL,對照組和模型組給予等體積胚胎培養水,置于28℃恒溫水浴箱中培養24h,避光(Lu et al.,2019;Wang et al., 2020)。

2.8.4斑馬魚腸道蠕動促進率的計算

治療結束后,用0.02%三卡因麻醉斑馬魚并固定在3%甲基纖維素中,然后從每組中隨機選取10尾斑馬魚,以便在熒光顯微鏡下捕獲腸道內容物的熒光強度。最后,使用Image J圖像處理軟件對斑馬魚腸道內容物的熒光信號強度(S)進行定量圖像分析。DLT中活性成分對腸道蠕動的影響計算公式如下:

腸道蠕動促進(%)=1-[(SDOM/實驗組?S對照組)/(S模型組-S對照組)]

2.9統計分析

所有統計分析均采用Graph Pad prism 8.0軟件(圣地亞哥,CA,USA)進行。數據以mean ±SEM表示。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),以P<0.05或P<0.01為差異有統計學意義。

3.結果

3.1不同溶劑提取的DLT化學成分圖譜的生成

在本實驗室前期工作的基礎上(https://doi.org/10.1016/j.jpba.2022.115086),建立了DLT5個不同組分的UPLC指紋圖譜。首先采用UPLC-Q-TOF-MS進行數據采集,結合文獻和TCMSP數據庫建立化學成分數據庫。其次,采用PeakView中的XIC對DLT的5個不同組分指紋圖譜進行分析。最后,根據其質譜信息包括保留時間、精確分子量、分子式和MS2提供的二次碎片,結合相關文獻數據和部分對照品,確定了化合物的結構。共指認出108個峰,不同組分之間DLT的化學成分分布有很大差異,不同組分之間的強度也存在差異。

3.2對正常小鼠腸道推進率的影響

3.2.1 DLT對正常小鼠腸道推進率的影響

為了獲得合適的給藥劑量,對正常小鼠給予不同劑量的DLT。以小鼠腸道推進率為藥效指標。結果表明,與低、中劑量給藥相比,DLT高劑量(10.5g/kg)的胃腸運動效果更好,與對照組相比具有顯著性差異。因此,選擇DLT不同組分的高劑量給藥進行下一步小鼠實驗。

3.2.2 DLT不同組分對正常小鼠腸道推進率的影響

各組小鼠腸道推進率研究結果表明,PE組、EE組、PA組、NB組對胃腸運動的影響均優于對照組。此外,WEAP組的活性最強,高劑量WEAP組小鼠的腸道推進率顯著優于對照組,兩個WEAP組給藥后對胃腸動力的影響與對照組有顯著差異,表明WEAP組分具有較好的藥效。

3.3多元統計分析

3.3.1主成分分析

主成分分析(PCA)是在無監督模式下進行的多元統計分析,主成分貢獻是所考察的隨機變量的方差在總方差中所占的比例,貢獻越高,說明樣本的代表性越強。前3個主成分的累積貢獻率高達80%,因此這3個主成分可以代表大部分的DLT,解釋108個峰的統計學意義。結果表明DLT的不同組分中的化學成分分離良好,結果解釋了5個組分中原型化合物變化的73.70%。豐度最高的前30個化合物主要成分為:川陳皮素(P94)、桔皮素(P98)、紫堇堿(P61)、5-羥基- 3-6,7-8,3 '-4 ' -六甲氧基黃酮(P96)、橙皮苷(P53)、延胡索乙素(P52)、別隱品堿(P44)、檸檬苦素(P90)、高圣草素(P58)、黃藤素(64)、前阿片堿(P41)、5 -O-去甲基川陳皮素(P102)等。

3.3.2灰色關聯分析

灰色關聯分析也是一種多元統計分析方法。根據平均關聯度值大于1進行篩選,依據各成分與藥效指標的灰色關聯度值結果,選取相關性較強的成分共43個,主要為黃酮類和生物堿類成分,包括:川陳皮素(P94)、柚皮素(P77)、橙皮素(P83)、去氫粗毛甘草素C(P86)、佛手酚(P66)、槲皮素(P68)、木香烴內酯(P104)、紫堇堿(P61)、桔皮素(P98)、延胡索乙素(P52)、檸檬苦素(P90)和5-O-去甲基川陳皮素(P102)等。但是,灰色關聯分析法也存在缺點,易受分辨系數的影響,關聯性為正,意味著它只能反映關聯性的強弱,而不能反映化學成分與藥效之間的負相關性。也就是說,不能完整、正確地分析化學成分對療效的綜合貢獻。

3.3.3 OPLS-DA分析

OPLS-DA分析包括得分散點圖、VIP預測、載荷散點圖和不同分數的DLT成分的排列測試。結果表明,OPLS-DA模型可以區分不同級分的DLT樣品,其累積統計量R2X=0.921,模型解釋率參數R2Y=0.998,預測能力參數Q2=0.980,基本參數均高于0.5,表明OPLS-DA模型對DLT的質量標志物分析具有較好的預測能力。根據VIP均值大于1篩選出與腸推進率相關性較強的成分共25個,主要為黃酮類和生物堿類成分,包括:桔皮素(P98)、5-羥基-3,6,7-8,3 ' -4 ' -六甲氧基黃酮(P96)、延胡索乙素(P52)、別隱品堿(P44)、黃藤素(P64)、甜橙素(P89)、5 -O-去甲基川陳皮素(P102)、紫堇堿(P61)、川陳皮素(P94)、橙皮苷(P53)、紫堇鱗莖堿(P51)、黃連堿(P45)和蘆?。≒29)等。

3.3.4統計分析與總結

由于每種統計方法都存在局限性和適應性,在以往的文獻中,一般采用單一的統計方法來研究一種譜效關系,其結果往往存在一定的偏差。為了得到更加科學可信的結果,研究人員采用了多元統計分析方法,包括PCA、GRA和OPLS-DA分析。結果表明,三種統計分析得到的10種常見成分可以交叉驗證,結果具有較高的置信度。因此,活性化合物桔皮素(P98)、延胡索乙素(P52)、5-O-去甲基川陳皮素(P102)、川陳皮素(P94)、紫堇堿(P61)、橙皮苷(P53)、金絲桃苷(P24)、紫堇鱗莖堿(P51)、檸檬苦素(P90)、氫化小蘗堿(P57)被認為是DLT的主要藥效化學標志物。

3.4網絡藥理學分析

3.4.1 DLT成分-靶點網絡構建與分析

通過Swiss Target Prediction數據庫,成功鑒定出688個藥物靶點。通過Cytoscape 3.8.2軟件構建“成分-靶點”網絡圖,可以直觀地顯示特定節點的拓撲特征,也可以顯示生物相互作用的一般特征。該圖有750個節點和4165條邊。節點所代表的區域越大,度值(Degree)越大,節點在網絡中越重要。節點之間的相互作用表明藥物活性成分與疾病靶點之間存在靶向關系。

3.4.2 DLT作用于FD的靶部位

3個數據庫及文獻檢索共獲得1964個與FD相關的靶點,通過韋恩圖分析得到308個與FD密切相關的共同靶點及成分靶點。該靶點與DLT對FD的治療作用密切相關。

3.4.3 PPI網絡的構建及核心靶點的挖掘

將上述得到的308個共有靶點導入STRING數據庫,設定物種為“人類”,剔除孤立靶點,得到266個靶點和PPI網絡。下載網絡的TSV格式文件PPI,然后使用Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化,結果顯示,該網絡共有266個節點和1556條邊。其中,節點代表FD治療的靶點,其大小與靶點的度值成正比,邊代表兩個靶點之間的相互作用,其厚度與相互作用的強度成正比。根據度值、中介數、接近中心度3個參數,選取中值以上的靶點為關鍵靶點,排名前10位的靶點分別為SRC、TP53、HSP90AA1、PIK3R1、STAT3、PIK3CA、MAPK3、MAPK1、HRAS、AKT1。

基于DLT治療FD的前10個核心靶點,根據Degree值對核心靶點對應的DLT胃腸活性成分進行排序。結果表明,川陳皮素、甜橙素、金絲桃苷、桔皮素、檸檬苦素、橙皮素、紫堇鱗莖堿、延胡索乙素、5-O-去甲基川陳皮素、四氫小檗堿等成分為DLT治療FD的關鍵成分。

3.5 DLT潛在的促腸蠕動成分對腸蠕動的影響

3.5.1最大耐受濃度的確定

為了獲得DLT中活性成分在斑馬魚體內的MTC,研究者觀察了各藥物處理24h后斑馬魚的死亡率(n=10)。根據這些結果,10和20μg/mL的桔皮素處理對斑馬魚沒有影響,但在40μg/mL時100 %(10/10)斑馬魚死亡。因此,確定桔皮素的MTC為20μg/m L。同樣,延胡索乙素的MTC被鑒定為37.5μg/mL;5 -O-去甲基川陳皮素為10μg/mL;而川陳皮素為12.5μg/mL;紫堇堿為37.5μg/mL;橙皮苷為200μg/mL;金絲桃苷為300μg/mL;檸檬苦素為200μg/mL;四氫小檗堿為75μg/mL。

3.5.2對斑馬魚幼魚腸蠕動的促進作用

DLT中的所有活性成分均被證明可以促進斑馬魚的腸蠕動,與模型組相比,桔皮素、延胡索乙素、5-O-去甲基川陳皮素、川陳皮素、紫堇堿、橙皮苷、金絲桃苷、檸檬苦素、四氫小檗堿對斑馬魚腸道運動的促進百分率分別為90.90%(P<0.01)、6.48%(P>0.05)、54.55%(P<0.01)、88.55%(P<0.01)、45.92%(P<0.05)、65.07%(P<0.01)、50.65%(P<0.01)、36.17%(P<0.05)和51.86%(P<0.01)。與之一致的是,在陽性對照藥物多潘立酮處理的斑馬魚中發現了90.02 %的(P<0.01)腸動力增強。

4.討論

FD是一種非器質性的上消化道疾病,可導致蠕動障礙,胃腸道微生物群、黏膜和免疫功能以及中樞神經系統功能的改變,目前FD的治療和管理方案并不特別令人滿意(Ha et al.,2023b)。但令人興奮的是,由于FD的癥狀相當于中醫藥理論中的中醫術語“痞”,因此中醫藥具有一些獨特的特質可以用來治療FD,這使得中醫藥特別適合治療FD(Yang et al.,2023)。DLT是由12味中藥組成的中藥復方制劑,臨床上用于治療FD。柴胡是DLT的主要藥物之一,始載于《神農本草經》,具有疏肝退熱、升陽通便、促進胃腸蠕動、潤燥通便等功效。另一種是枳實,傳統上認為枳實可單獨或與其他藥物合用緩解消化不良和胃腸功能的障礙(Gao et al.,2020)。此外,木香已被推薦用于治療胃腸病,因為它已被證明具有理氣解郁、溫中散寒、和胃止痛、潤腸止瀉的功效(Chen et al.,2022)。在本實驗室前期研究的基礎上,采用UPLC-Q-飛行時間結合非靶向特征濾膜分析和計算機預測策略(NCFS)對大鼠口服DLT后生物樣品中的化學成分和體內代謝物進行鑒定。值得慶幸的是,本研究通過斑馬魚腸蠕動模型驗證了活性成分的藥效,為DLT在臨床上抗FD提供了藥理學和物質基礎。

現如今,越來越多的研究者關注中藥活性成分與藥效之間的聯系,并采用譜效關系分析,以期更清晰地篩選出真正能發揮臨床療效的成分。同時,代謝組學、網絡藥理學分析可以作為篩選重要活性成分的一種方法?;瘜W計量學分析方法的選擇對于這種譜效分析是非常重要的,因為不同的方法可以強調不同的發現。在PCA中,它是一種模式識別分析,通過使用線性變換將原始的多數變量轉化為新的少數類變量(Li et al.,2023),從而降低數據的維度和復雜性。與PCA相比,OPLS-DA不僅能夠識別樣本差異,而且能夠獲得樣本差異的特征標志物(Qiao,R. et al.,2021)。然而,GRA更精確,因為它需要數據標準化。在本研究中,我們采用“譜效關系-網絡藥理學”的策略來篩選活性成分,我們的大部分研究結果通過斑馬魚腸蠕動模型得到了支持。

胃腸病學領域的疾病模型越來越注重使用替代的非嚙齒類動物,為慢性疾病的研究提供新的實驗工具(Cheng et al.,2016)。斑馬魚由于其獨特的優勢,是胃腸道疾病模型的巨大替代者。令人驚訝的是,用于藥物篩選和評價的新型斑馬魚腸道動力模型已被成功建立和應用。并且洛哌丁胺誘導的小鼠FD已被廣泛用于評估TCM的療效和機制研究(Hwang et al.,2021; Jeon et al.,2019)。我們成功地利用了洛哌丁胺誘導的斑馬魚FD模型來驗證DLT中活性成分的功效。在功能性消化不良的病理條件下,斑馬魚表現出胃排空延遲,證明我們的模型是可靠的、可重復的。我們發現桔皮素、延胡索乙素、5-O-去甲基川陳皮素、川陳皮素、紫堇堿、橙皮苷、金絲桃苷、檸檬苦素、四氫小檗堿均能促進腸蠕動。所有樣品均有不同程度的緩解作用,其中桔皮素和川陳皮素組的抗FD作用優于其他配伍比例,與陽性藥多潘立酮相當。值得注意的是,盡管沒有相應的文獻對這些活性成分的功效進行研究,但先前的研究表明,柴胡和陳皮是治療FD的TCM(Ha et al.,2023a)。

巧合的是,我們還發現橙皮苷改善了洛哌丁胺誘導的便秘大鼠模型的結腸動力,這可能是我們研究結果的佐證(Wu et al.,2020)。此外,腸道菌群在胃腸道疾病中發揮著重要作用,調節菌群也可能是保護腸道的一種方式。那么,草藥和內源性代謝物可能成為一個很有前途的調節劑(Song et al.,2022a)。

本研究采用UPLC-Q-MS/ MS技術對DLT不同溶劑提取的共有成分進行分析,結合藥效數據,構建化學成分相對含量與治療FD療效的相關性。綜上所述,我們的研究在整合譜效關系和網絡藥理學策略的基礎上篩選了活性成分,并在斑馬魚腸動力模型上進行了驗證。這些發現為DLT治療FD的臨床評價打開了大門,為確證DLT治療FD的作用靶點、藥效化學標志物和生物標志物提供了依據。

5.結論

DLT的抗功能消化不良作用的具體活性成分尚不清楚。本研究采用UHPLC-Q-TOF MS技術對DLT不同溶劑提取的化學成分進行全面表征,然后根據譜效關系和網絡藥理學篩選共有成分,并在鹽酸洛哌丁胺誘導的斑馬魚腸蠕動模型中進行相應的藥效學評價。本研究不僅探索了DLT抗功能消化不良的作用靶點、篩選了DLT抗功能性消化不良的活性成分,還對其藥效進行了驗證,發現DLT的大部分活性成分有助于抗功能性消化不良。

 

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